Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2004 Mar 2; 101(9): 3065-70

Roland Heynkes, 17.5.2004 (zuletzt ergänzt am 22.5.2004)

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Casalone,C.; Zanusso,G.; Acutis,P.; Ferrari,S.; Capucci,L.; Tagliavini,F.; Monaco,S.; Caramelli,M. - Identification of a second bovine amyloidotic spongiform encephalopathy: Molecular similarities with sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. - Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2004 Mar 2; 101(9): 3065-70

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Seit der Einführung einer aktiven BSE-Überwachung im Januar 2001 wurden in Italien bis August 2003 immerhin 1.638.275 gesetzlich vorgeschriebene BSE-Tests durchgeführt und 103 BSE-Fälle diagnostiziert. Mit 103 BSE-Fällen bei 1.638.275 BSE-Tests (15.906 Tests / BSE-Fall) hat also Italien bezogen auf die getestete Population rund doppelt soviele BSE-Fälle wie Deutschland mit bis dahin 305 BSE-Fällen unter mehr als 9 Millionen Tests (30.068 Tests / BSE-Fall). Von Januar 2001 bis März 2004 wurden in Deutschland 9.170.883 BSE-Schnelltests durchgeführt [BVM1], wobei das BMVEL zu erwähnen vergisst, daß darin die in Deutschland relativ häufig (25% in 2001 [EUK1], 26% in 2002 [EUK2]) durchgeführten freiwilligen BSE-Tests mit eingeschlossen sind. Da im Alter von unter 24 Monaten positive Schnelltest-Ergebnisse selbst bei direkt nach der Geburt mit BSE infizierten Rindern äußerst unwahrscheinlich sind, muß man von den deutschen Testzahlen 25% abziehen, um sie in dieser Hinsicht mit anderen EU-Ländern vergleichbar zu machen. Im Vergleich mit Italien sind daher nur 6,9 Millionen deutschen BSE-Tests zu berücksichtigen. Damit steigt dann auch unsere vergleichbare Quote auf 22.551 Tests / BSE-Fall, sodaß Deutschland kaum noch besser als Italien dasteht. Erstaunlich ist aber die relativ geringe Zahl italienischer BSE-Tests, denn Italien hat mit 6,73 Millionen gut halb so viele Rinder wie Deutschland mit 13,35 Millionen (http://ticker-grosstiere.animal-health-online.de/20040520-00000/) und sollte daher mit rund 3 Millionen fast doppelt so viele Tests durchgeführt haben, selbst wenn Rinder dort erst ab dem Alter von 30 Monaten getestet werden müssen.

Die Probenentnahme erfolgte stets im Stammhirn (Obex, Medulla oblongata) und die Bestätigung erfolgte in allen Fällen durch den Nachweis proteaseresistenten Prionproteins in Western blot und Immunhistochemie. Dies bedeutet, daß der Nachweis schwierig wird, wenn die Ablagerung des PrPsc nicht wie erwartet bevorzugt im Obex erfolgte. Nahezu unmöglich wäre mit den heute üblichen BSE-Schnelltests die Entdeckung einer BSE-Variante, bei der wie bei einer norwegischen Scrapie-Variante [APFF] das PrPsc kaum proteaseresistent wäre. Andererseits hätte es mit diesen Methoden aber eigentlich auch ohne eine spezielle Untersuchung auffallen müssen, wenn bei einem BSE-Rind das proteaseresistente Prionprotein-Fragment eine abweichende Größe, ein ungewöhnliches Glykosilierungsmuster oder eine andere Verteilung im Gehirn aufweist. Seltsamerweise berichten aber die Autoren, daß sie über Monate sammeln mussten, um gerade mal 8 BSE-Fälle (4 Schwarzbunte (Frisian), 3 Braunvieh-Rinder (Bruna Alpina) und 1 Piemonteser Fleischrind) zusammen zu bekommen, bei denen sie sich die Western blots und die Bilder der Immunhistochemie genauer ansehen konnten. Seltsam ist auch, daß die von den Autoren genannten Fälle in dieser Reihenfolge auch nicht annähernd in der offiziellen Liste der italienischen BSE-Fälle zu finden sind [CEA1]. Die Autoren hätten eigentlich darstellen müssen, nach welchen Kriterien sie die von ihnen näher untersuchten Tiere ausgesucht haben oder ob sie eher zufällig einfach nur Probenmaterial von älteren Fällen erhielten.

Einzelheiten zu den 8 untersuchten BSE-Fällen
Code Rasse Alter Oktapeptide in beiden Allelen andere Polymorphismen in beiden Allelen PrP-amyloide Plaques stärkste Bande im Western blot
1088 Piemontese 15 6/6 Wildtyp (CAG/CAG) + 1x glykosiliert
109655 Bruna Alpina 5 5/7 Wildtyp (Q/Q) 0 2x glykosiliert
102417 Friesian 9 6/6 Wildtyp 0 2x glykosiliert
141387 Bruna Alpina 11 6/7 Codon 70 CAG/CAA,Q/Q) + 1x glykosiliert
78437 Bruna Alpina 5 7/7 Codon 70 CAA/CAA,Q/Q) 0 2x glykosiliert
16193 Friesian 5 6/6 Codon 70 CAG/CAA,(Q/Q) 0 2x glykosiliert
128204 Friesian 7 6/6 Wildtyp 0 2x glykosiliert
72797 Friesian 8 6/6 Codon 70 CAG/CAA,(Q/Q) 0 2x glykosiliert

Mit geeigneten Oligonukleotid-Starter-Molekülen wurden aus der genomischen DNA der acht BSE-Tiere selektiv die Prionprotein-Gene per PCR vermehrt und anschließend sequenziert. Die Autoren fanden eine gewisse Variabilität hinsichtlich der zwischen 5 und 7 schwankenden Zahl der Oktapeptid-Sequenzen und des Codons 70, in dem sie teilweise eine stille Mutation ohne Auswirkung auf die Aminosäuren-Sequenz fanden. Auswirkungen stiller Mutationen auf BSE sind kaum vorstellbar, aber auch für die Unterschiede hinsichtlich der Zahl der Oktapeptide im Prionprotein ist kein Zusammenhang mit den phänotypischen Stammeigenschaften erkennbar. Es ist ja lange bekannt, daß die uralte Rasse Braunvieh im Bezug auf die Oktapeptide variabel ist [AKMY] (http://www.mad-cow.org/~tom/apr99_sci.html#cccc), aber die mutmaßliche neue BSE-Variante trat auch beim Wildtyp auf und nur ein Tier mit einem zusätzlichen Oktapeptid fiel auch phänotypisch aus dem Rahmen.

Die proteaseresistenten Prionprotein-Fragmente wiesen in den beiden alternativen Fällen eine reduzierte Größe und ein abweichendes Glykosilierungsmuster auf. Während normalerweise bei BSE die an beiden Glykosilierungsstellen glykosilierten Prionproteine dominieren, fand man bei den abweichenden Fällen besonders viel einfach glykosiliertes Prionprotein, aber auch verstärkt die gar nicht glykosilierte Form. Anhand der Muster im Western blot weisen die Autoren auf eine Ähnlichkeit zu sporadischen CJK-Fällen des Typs 2 [AJEY,AJET] bei hinsichtlich der Aminosäure 129 des Prionproteins Methionin/Valin-heterozygoten Menschen hin. Mit dieser Ähnlichkeit der molekularen Signaturen begründen die Autoren eine noch laufende Stamm-Typisierung in Mäusen, obwohl Übertragungsexperimente und Stamm-Typisierungen bei jeder neuen TSE-Variante obligatorisch sein sollten. Schließlich ist der Nachweis relativ proteaseresistenten Prionproteins nicht grundsätzlich gleichbedeutend mit einem Nachweis von PrPsc im Sinne infektiösen Materials [ANXG]. Die Typ-2-CJK ähnelt der mutmaßlichen neuen BSE-Variante auch bezüglich des Auftretens amyloider Plaques, aber die PrPsc-Verteilung im Gehirn ist anders. Dort findet man das PrPsc besonders im Kleinhirn (Cerebellum), Stammhirn (Truncus encephali) und Striatum.

Normalerweise findet man die Prionprotein-Ablagerungen körnig im neuronalen Zytoplasma und im Neuropil der grauen Substanz, langestreckt faserig oder sternförmig wie Gliazellen. Immunhistochemisch gefärbte Hirnschnitte normaler BSE-Rinder sehen aus, als ob Farbflecke auf Aquarell-Papier breit verlaufen wären. Bei den beiden relativ alten BSE-Kühen mit der kleineren und weniger glykosilierten PrPsc-Variante fanden die Autoren regelrechte amyloide Plaques, also sehr dichte, kugelförmige Tropfen verfilzten Prionproteins mit Durchmessern bis zu 25 µm inmitten größerer praktisch ungefärbter Areale. Diese beiden Gehirne wiesen auch granular zwischen den Zellen aggregiertes PrPsc auf, aber diese eher diffusen Ablagerungen waren viel schwächer als normal ausgeprägt und genau wie gelegentlich sternförmige Ablagerungen auf den Bildern kaum zu erkennen. Die Italiener nannten deshalb ihre neue Variante bovine amyloidotic spongiform encephalopathy (BASE). Möglicherweise handelt es sich aber auch nur um einen altersbedingten Effekt. Innerhalb der amyloiden Plaques konnten die Autoren Bündel unverzweigter Fibrillen mit Durchmessern von rund 7 nm erkennen.

Normalerweise wird das proteaseresistente Prionprotein in Thalamus, Hypothalamus und vor allem im Stammhirn (Truncus encephali) nachgewiesen, aber nur in sehr geringen Konzentrationen in Riechkolben (Bulbus olfactorius) und Riechrinde (Pyriformer Cortex). Bei den neuartigen Fällen hingegen fand man es hauptsächlich im Thalamus und im Riechkolben (Bulbus olfactorius), aber auch in der Riechrinde (Pyriformer Cortex) sowie im Hippocampus. In Hypothalamus und Hirnstamm (Truncus encephali) dieser Tiere war wenig, im Putamen und im Obex sehr wenig PrPsc nachweisbar. Die Autoren fanden gar keines im dorsalen Nukleus des Vagus-Nerven, über den ja Prionen direkt vom Darm in die Medulla oblongata wandern könnten. Insgesamt waren in den Gehirnen der beiden neuartigen BSE-Fälle deutlich mehr Strukturen betroffen. Sollte dies auch im restlichen Körper der Fall sein, dann könnte dies Auswirkungen auf die BSE-Sicherheit der Verbraucher haben. Jedenfalls kann man angsichts der ganz anderen PrPsc-Verteilung in den Gehirnen nicht einfach ungeprüft davon ausgehen, daß diese neue BSE-Variante ebenso extrem wie die klassische BSE-Form auf das Zentralnervensystem konzentriert ist. Neben dem Blutkreislauf (Selbst eine intakte Blut-Hirn-Schranke scheint für PrPsc kein Hindernis darzustellen [AQGQ].) weist das Gehirn prinzipiell vier mögliche neuronale Eintrittspforten für Prionen auf: das Rückenmark, in die Peripherie reichende Nerven wie insbesondere den Nervus vagus, die Sehnerven, aber auch die Riechnerven. Die in den beiden neuartigen BSE-Fällen sehr geringen PrPsc-Konzentrationen an den Eintrittsstellen von Rückenmark und Nervus vagus könnten einfach darauf zurückzuführen sein, daß die offensichtlich abweichenden molekularen Eigenschaften der Prionen auch eine abweichende Selektivität für bestimmten Nervengewebe zur Folge hat. Es kann aber auch sein, daß die Prionen nicht durch Rückenmark oder den Nervus vagus, sondern über die Riechnerven ins Gehirn gelangten und daß deshalb Riechkolben (Bulbus olfactorius) und Riechrinde (Pyriformer Cortex) in diesen Fällen so besonders stark betroffen sind. Gegen eine Aufnahme der Infektiosität durch den Magen-Darm-Trakt spricht auch das ungewöhnlich hohe Alter dieser Tiere. Bei beiden lag das Alter weit jenseits der durchschnittlichen Inkubationszeit von gut 5 Jahren [HEY1], sodaß sie wahrscheinlich erst als erwachsene Rinder infiziert wurden. Bei erwachsenen Rindern ist aber die Darmflora bereits in der Lage, Prionen größtenteils abzubauen [AOXW]. Dies erklärt, warum die britischen BSE-Rinder ganz überwiegend in ihren ersten Lebenswochen infiziert wurden [ANDI]. Das bedeutet aber auch, daß bei besonders alten BSE-Fällen auf alternative Infektionspforten zu achten ist. Dazu zählt neben Augen [ANDK] und der relativ verletzungsgefährdeten Zunge [ANDW] auch die Nase, die bei Rindern anatomisch bedingt häufig staubförmige Teile des Futters inhaliert. Die beiden Rinder müssen auch nicht unbedingt durch Rinder-Prionen im Futter infiziert worden sein. Theoretisch könnten sie auch versehentlich Teile toter Nager mit einem adaptierten BSE-Stamm gefressen haben.

Die namensgebenden spongiformen Veränderungen waren in allen 8 BSE-Gehirnen wenig verbreitet. Nur stellenweise fand man die Vakuolen im Stammhirn (Truncus encephali) (im und rostral vom Obex). In vorderen, seitlichen und hinteren Regionen der Hirnrinde, in Riechkolben (Bulbus olfactorius), Riechrinde (Pyriformer Cortex) und Hippocampus fanden die Autoren keine Vakuolen. Milde spongiforme Degeneration sahen sie nur bei 2 Schwarzbunten im Thalamus. Die Autoren erklären die sehr geringe Durchlöcherung ihrer BSE-Gehirne damit, daß die BSE-Tests Infektionen schon Monate vor der Erkrankung erkennen. Diese Erklärung wäre allerdings glaubwürdiger, wenn die Autoren Informationen darüber geliefert hätten, ob die von ihnen untersuchten Rinder tatsächlich gesund geschlachtet wurden. Für ein Tier lässt sich diese Frage beantworten, weil es in Italien nur einen Fall von BSE bei einem Rind der Rasse Piemontese gab (http://www.izsto.it/ceaBSE2003.htm). Dieses wurde allerdings nicht normal geschlachtet, sondern war gestorben.

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AQGQ . Banks,W.A.; Niehoff,M.L.; Adessi,C.; Soto,C. - Passage of murine scrapie prion protein across the mouse vascular blood-brain barrier - Biochemical and Biophysical Research Communications 2004 May 21; 318(1): 125-30

ANDW . Bartz,J.C.; Kincaid,A.E.; Bessen,R.A. - Rapid prion neuroinvasion following tongue infection - Journal of Virology 2003 Jan; 77(1): 583-91

APFF . Benestad,S.L.; Sarradin,P.; Thu,B.; Schonheit,J.; Tranulis,M.A.; Bratberg,B. - Cases of scrapie with unusual features in Norway and designation of a new type, Nor98 - Veterinary Record 2003 Aug 16; 153(7): 202-8

BVM1 . Bundesministerium für Verbraucherschutz, Ernährung und Landwirtschaft - Zahl der durchgeführten BSE-Tests im Berichtszeitraum - http://www3.verbraucherministerium.de/index-057841728E704358997B3A06EE928514.html

CEA1 . Centro di referenza per le encefalopatie animali - Focolai BSE in Italia: 2001/2002/2003/2004 - http://www.izsto.it/ceafoc_bse.htm

ANXG . Chiesa,R.; Piccardo,P.; Quaglio,E.; Drisaldi,B.; Si-Hoe,S.L.; Takao,M.; Ghetti,B.; Harris,D.A. - Molecular Distinction between Pathogenic and Infectious Properties of the Prion Protein - Journal of Virology 2003 Jul 1; 77(13): 7611-7622

EUK1 . EU-Kommission - Report on the monitoring and testing of bovine animals for the presence of bovine spongiform encephalopathy (BSE) in 2001 - Tabelle 23, http://europa.eu.int/comm/food/food/biosafety/bse/bse45_en.pdf

EUK2 . EU-Kommission, Directorate D - Food Safety: production and distribution chain, D2 – Biological risks - Report on the monitoring and testing of ruminants for the presence of transmissible spongiform encephalopathy (TSE) in 2002 - Tabelle 26, http://europa.eu.int/comm/food/food/biosafety/bse/annual_report_2002_en.pdf

ANDK . Heynkes,R. - Spielt die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit eine Rolle bei Augenoperationen, Augeninnendruckmessungen und dem Probieren von Kontaktlinsen? - http://www.heynkes.de/hornhaut.htm

ANDI . Heynkes,R. - Die meisten BSE-Kühe wurden als Kälber infiziert - http://www.heynkes.de/peaks.htm

HEY1 . Heynkes,R. - Tabellarische Auswertung der Statistik britischer BSE-Herden mit bekannter Altersstruktur - http://www.heynkes.de/herdstat.htm#Fazit

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AJET . Parchi,P.; Giese,A.; Capellari,S.; Brown,P.; Schulz-Schaeffer,W.J.; Windl,O.; Zerr,I.; Budka,H.; Kopp,N.; Piccardo,P.; Poser,S.; Rojiani,A.; Streichemberger,N.; Julien,J.; Vital,C.; Ghetti,B.; Gambetti,P.; Kretzschmar,H.A. - Classification of sporadic Creutzfeldt-Jakob disease based on molecular and phenotypic analysis of 300 subjects - Annals of Neurology 1999 Aug; 46(2): 224-33

AJEY . Parchi,P.; Castellani,R.J.; Capellari,S.; Ghetti,B.; Young,K.; Chen,S.G.; Farlow,M.; Dickson,D.W.; Sima,A.A.; Trojanowski,J.Q.; Petersen,R.B.; Gambetti,P. - Molecular basis of phenotypic variability in sporadic Creutzfeldt-Jakob disease - Annals of Neurology 1996 Jun; 39(6): 767-78

AOXW . Pichner,R.; Scherbel,C.; Mueller,S.; Scherer,S.; Groschup,M.; Dietrich,R.; Maertlbauer,E.; Gareis,M. - Microbial inactivation of TSE-prions by the complex microflora of the gastrointestinal tract - International Conference - Prion diseases: from basic research to intervention concepts - TSE-Forum, 08.10.-10.10.2003, Gasteig, München - Poster session - BR-96

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