Journal of Virology 2005 Oct; 79(19): 12355-64

Roland Heynkes, 24.7.2006

Gliederung

zum Text bibliographische Angaben
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Pan,T.; Chang,B.; Wong,P.; Li,C.; Li,R.; Kang,S.C.; Robinson,J.D.; Thompsett,A.R.; Tein,P.; Yin,S.; Barnard,G.; McConnell,I.; Brown,D.R.; Wisniewski,T.; Sy,M.-S. - An aggregation-specific enzyme-linked immunosorbent assay: detection of conformational differences between recombinant PrP protein dimers and PrPsc aggregates. - Journal of Virology 2005 Oct; 79(19): 12355-64

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Die Autoren stellten per Western blot fest, daß rekombinante Prionproteine mit den Sequenzen von Mensch, Maus, Schaf und Rind Dimere bildeten, sofern nicht durch reduzierende Bedingungen die Bildung von Disulfidbrücken verhindert wurde.

Normalerweise bindet beim ELISA ein gebundener Antikörper ein Antigen, an welches danach über ein zweites Epitop ein mobiler zweiter Antikörper bindet, der schließlich über eine Farbreaktion sichtbar gemacht wird. Man benötigt zwei verschiedene Antikörper, weil zumindest bei Proteinen normalerweise jede Oberflächenstruktur auf dem Antigen nur einmal vorkommt. Wenn allerdings das Prionprotein Dimere oder Oligomere bildet, dann muß es Epitope geben, die zwei- oder mehrfach auf dem Dimer oder Oligomer vorkommen. Entsprechend sollten sich Antikörper produzieren lassen, mit denen sich Prionprotein-Aggregate binden und anschließend auch markieren lassen. Diesen ELISA mit nur einer Sorte Antikörper zum Binden und Markieren nennen die Autoren aggregationsspezifischen ELISA.

Die Autoren untersuchten bei 30 gegen Prionprotein-Epitope gerichteten monoklonaten Antikörpern, ob diese brauchbar für den aggregationsspezifischen ELISA sind. Dies war tatsächlich bei mehreren Antikörpern der Fall. Vier markierten Dimere aus rekombinantem Prionprotein und vier reagierten spezifisch positiv auf Hirn-Homogenat von mit dem Maus-adaptierten Scrapiestamm ME7 infizierten Mäusen. Aber nur der Antikörper 11G5 band die PrPc-Dimere mit den Sequenzen von Mensch, Maus, Schaf und Rind und außerdem das ME7-PrPsc. Demnach müssen die PrP-Dimere und das PrPsc unterschiedliche Strukturen besitzen.

Der gegen ein Epitop im Bereich der besonders konservierten Aminosäuren 115-130 gerichtete Antikörper 11G5 markiert auch PrPsc aus Hirn-Homogenaten von Mäusen, die mit den Maus-adaptierten Scrapiestämmen 22L und 139A infiziert wurden. Die Spezifität für Aggregate normalen Prionproteins und für PrPsc resultiert aber nur aus der speziellen ELISA-Methode, denn natürlich erkennt ein PrPc-Dimere markierender Antikörper auch PrPc-Monomere.

Der aggregationsspezifische ELISA ist auch sehr sensitiv. Weil PrPsc-Aggregate mehrfach markiert werden können, waren die Signalstärken mit ME7-Hirn-Homogenaten um 300% höher als mit PrPc-Dimeren. Der Test funktioniert aber besser mit kleineren PrPsc-Aggregaten als mit sehr großen, die möglicherweise leichter von den bindenden Antikörpern abfallen.

Bei ME7-inokulierten CD-1-Mäusen traten die ersten eindeutigen Symptome nach rund 140 Tagen auf und nach etwa 170 Tagen mussten sie getötet werden. Der Test reagierte aber schon nach 70 klar positiv, als im Western blot noch nichts zu erkennen war. Ein weiterer Vorteil dieses Verfahrens ist die Möglichkeit, auf den so problematischen Proteinase-K-Verdau in TSE-Tests verzichten zu können.

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