NR ALNN
AU Taylor,D.M.; Ferguson,C.E.; Bostock,C.J.; Dawson,M.
TI Absence of disease in mice receiving milk from cows with bovine spongiform encephalopathy
QU The Veterinary Record 1995 Jun 10; 136(23): 592
PT journal article
VT
NUMEROUS tissues and secretions from cattle confirmed to be naturally affected with bovine spongiform encephalopathy (BSE) have been injected into or fed to mice and, with the exception of brain and spinal cord, all have failed to transmit disease (Barlow and Middleton 1990, Fraser and others 1992, Fraser and Foster 1994). This brief report describes experiments in which milk from cows with confirmed BSE was given to mice by drinking or injection.
Ten litres of milk were collected from each of six pregnant cows showing clinical signs of having bovine spongiform encephalopathy (BSE) which was confirmed subsequently by neurohistopathological examination. Two of the cases were in early lactation (EL), two in mid-lactation (ML) and two in late lactation (LL). Aliquots from each sample were injected into groups of RIII/FaDk weanling mice by the combined intracerebral (0.02 ml) and intraperitoneal (0.1 ml) routes: following inoculation the mice were observed for up to 653 days for clinical signs of neurological disease. Other groups of RIII were permitted to drink each milk sample by substituting milk for drinking water at a rate of 10 ml per mouse per day for a total of 40 days. Of the 400 ml of milk offered to each mouse the average consumption was 300 ml. These mice were observed for clinical neuropathological disease for up to 702 days. Brains from all mice were exammed neuro-histopathologically.
None of the mice developed clinical signs of neurological disease, spongiform encephalopathy or other specific pathology. Table 1 shows the numbers of mice in each of the injection or drinking experiments. As in all long term bioassays, there were intercurrent losses. Those mice which died less than 300 days after the experiments were initiated have been omitted from the data because it is known from the titration of infectivity in three BSE-affected bovine brains that the minimum incubation period in RIII mice was 317 days. This compares with an average incubation period of 424 days in mice injected with limiting dilutions of infectivity (H. Fraser, personal communication). Table I also identifies the numbers of mice surviving beyond 600 days which approximates to the longest incubation period observed in individual RIII mice injected with homogenised and diluted but otherwise untreated BSE infected brain or spinal cord material (Taylor and others 1994, H. Fraser, personal communication).
The average volume of milk that was consumed by mice was 300 ml and represents the only controlled method to assay infectivity in large volumes of material by transmission to mice. Such a volume is equivalent, on a weight-to-weight basis, of an average human adult (taken as 70 kg) consuming a pint of milk from a BSE-affected cow per day for 6.75 years. Such a comparison may not accurately reflect the risk factor for man, since total dose of infectivity is more likely to be related to the absolute volume of milk consumed than to the relative volume related on a body-weight basis. Even though negative transmission following intracerebral inoculation involved a very small volume (20 µl) of milk, the failure to detect infectivity is reassuring. One estimate of the relative efficiency of the intracerebral versus the oral routes of infection of mice with BSE-affected material suggests that intracerebral injection is some 2x10^5 more efficient than oral challenge (Kimberlin 1994). On this basis an intracerebral inoculation of 20 µl is an equivalent dose to a mouse orally consuming about 4 litres of milk.
The results show that no neurological disease occurred in any of the 275 mice which survived for more than 300 days after drinking or injection with milk from cases of BSE. This adds to the considerable number of bovine tissues and secretions which have failed to demonstrate any BSE infectivity in bioassay in RIII mice.
Acknowledgement. - This work was funded by a grant from the Ministry of Agriculture, Fisheries and Food.
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TABLE 1: Numbers of animals dead or culled without neurological disease at different times (days) after intracerebral (IC) injection with, or drinking, milk
300-450 451-600 601-702*
Milchprobe IC Oral IC Oral IC Oral
ELI 4 4 3 5 19 11
EL2 3 4 8 3 16 15
ML1 7 5 7 5 12 11
ML2 5 2 6 4 18 11
LLI 4 3 6 3 19 13
LL2 2 4 13 5 4 11
* The experimental challenge of mice by IC inoculation was terminated after 653 days post inoculation
IN
Von 6 klinisch an BSE erkrankten tragenden Kühen in verschiedenen Phasen der Laktation wurden jeweils 10 Liter Milch gewonnen. Mit jeder Probe wurde eine Gruppe junger RIII/FaDk-Mäuse mit jeweils 20 µl intracerebral und 100 µl intraperitoneal inokuliert. Die Mäuse wurden bis zu 653 Tage beobachtet. Anderen Mäusen wurden 40 Tage lang 10 ml Milch pro Tag und Maus angeboten, von denen durchschnittlich insgesamt 300 ml konsumiert wurden. Diese Mäuse wurden bis zu 702 Tage lang beobachtet. 88 intracerebral und 72 oral inokulierte Mäuse wurden mehr als 600 Tage beobachtet und 275 Mäuse überlebten mindestens 300 Tage. Alle gestorbenen oder getöteten Tiere wurden neurohistopathologisch untersucht und bei keiner Maus wurden irgendwelche Anzeichen für BSE-Infektionen gefunden. Die Publikation macht keinerlei Angaben darüber, welche Arbeiten in der Abteilung für Pathogenese (Taylor, Edinburgh) oder im Compton-Labor (Ferguson und Bostock) des Institutes für Tiergesundheit, oder im zentralen Veterinärlabor in New Haw (Dawson) bei Addlestone und Weybridge im Südwesten Londons (Surrey) durchgeführt wurden.
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Zahlen der innerhalb bestimmter Beobachtungszeiträume nach der intrazerebralen bzw. oralen Inokulation ohne neurologische Störungen gestorbenen oder getöteten RIII-Mäuse
300-450 451-600 601-702*
Milchprobe IC Oral IC Oral IC Oral
ELI 4 4 3 5 19 11
EL2 3 4 8 3 16 15
ML1 7 5 7 5 12 11
ML2 5 2 6 4 18 11
LLI 4 3 6 3 19 13
LL2 2 4 13 5 4 11
Summe 25 22 43 25 88 72
* Die intrazerebral inokulierten Mäuse wurden spätestens nach 653 Tagen getötet.
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Die Aufnahme von Infektiosität über die Nahrung ist kaum vergleichbar mit einer Injektion direkt ins Gehirn. Daher stellt die Tabelle dieses Artikels eigentlich die Ergebnisse zweier Experimente dar, die auch separat bewertet werden sollen.
Ein halbes Jahrzehnt nach der hier beschriebenen Arbeit fütterte Taylor in einem vergleichbaren Experiment 15 RIII-Mäuse mit jeweils 300 mg BSE-infektiösen Hirnhomogenates [ALMQ]. Daraus resultierend erkrankten 12 der 15 Mäuse und die längste Inkubationszeit betrug 547 Tage [ALMQ]. Leider machen die Autoren dieses späteren Artikels keine Angaben über die Inkubationszeiten der übrigen erkrankten Mäuse [ALMQ]. Aber in einem ebenfalls vergleichbaren Verfütterungsexperiment erkrankten 5 von 7 mit durchschnittlich je 9,1 g Gehirnhomogenat plus 4,5 ml Hirn- und Rückenmarksflüssigkeit gefütterten C57B1-Mäusen 435-504 Tage nach Beginn der Fütterung [ANCB,ANCC]. Weil sich zumindest nach intrazerebraler Inokulation die beiden Mausstämme nur hinsichtlich der Inkubationszeiten, nicht aber hinsichtlich der Infizierbarkeit und der Variabilität der Inkubationszeiten unterscheiden [AEEK], dürften sich die Inkubationszeiten der 12 mit je 300 mg BSE-infektiösen Hirnhomogenates gefütterten RIII-Mäuse [ALMQ] zwischen 460 und 547 Tagen bewegt haben. Bei den nach oraler Inokulation maximal 450 Tage lang beobachteten 22 RIII-Mäusen wäre also nicht einmal dann eine Erkrankung aufgetreten, wenn sie mit 300 ml Hirnhomogenat gefüttert worden wären. Diese 22 Tiere haben also überhaupt nichts in einer Kalkulation der BSE-Sicherheit von Milch zu suchen.
Man konnte aber auch bei den restlichen 97 oral inokulierten RIII-Mäusen keine oder höchstens sehr wenige Erkrankungen erwarten, wenn schon je 300 mg eines 10%igen Hirnhomogenates einer BSE-Kuh nur 12 von 15 RIII-Mäusen infizierten [ALMQ]. Umgerechnet auf die 97 entspräche das 78 infizierten Mäusen und schon bei einer um nur 2 Größenordnungen geringeren Infektiosität wäre man unter der Nachweisgrenze. Das ganze Teilexperiment mit der Verfütterung von je 300 ml Milch sagt also lediglich aus, dass das Gehirn BSE-kranker Kühe mindestens 1000-fach infektiöser als die Milch solcher Tiere ist.
Weniger wirklichkeitsnah als die Verfütterung, dafür aber wesentlich geeigneter für den Nachweis geringer Errermengen ist das Injizieren direkt ins Gehirn der Mäuse. Aber ein Titrationsexperiment mit RIII-Mäusen und hochinfektösem Hirnhomogenat einer BSE-kranken Kuh zeigte, dass man bei intrazerebraler Inokulation von 20 µl bereits ab einer Verdünnung um den Faktor 1000 mit Inkubationszeiten um die 450 Tage rechnen muß [AEEK]. Daher konnte man bei den 25 nur 300-450 Tage nach der intrazerebralen Inokulation von Milch beobachteten RIII-Mäusen überhaupt keine Erkrankungen erwarten. Also verbleiben noch 131 mit jeweils 20 µl intrazerebral inokulierte RIII-Mäuse, die lange genug lebten, um trotz einer um 3 Größenordnungen geringeren Infektiosität des injizierten Materials zu erkranken.
Aber neben der Inkubationszeit wirkt sich eine geringere Infektiosität ja vor allem auf den Anteil der erkrankten Mäuse aus. In besagtem Titrationsexperiment wurden auf jeder Verdünnungsstufe 12 RIII-Mäuse eingesetzt und ab einer 10.000-fachen Verdünnung erkrankten nur noch einzelne Tiere [AEEK]. Bei 131 Mäusen könnte also Milch ein 1/100.000 der Infektiosität von Gehirn BSE-kranker Rinder haben, ohne das man dies in diesem Experiment bemerkt hätte.
Außerdem darf man nicht vergessen, dass die Zusammensetzung und insbesondere der Zellgehalt von Milch nicht immer gleich ist. Für dieses Experiment wurden immerhin 6 Milchproben aus verschiedenen Abschnitten der Laktation gesammelt, aber es bleiben doch nur Stichproben. Daher schließen die Resultate dieses Experperimentes nicht aus, dass bei BSE-kranken Kühen der Abstand der Infektiositäten von Milch und Gehirn zeitweise weniger als 5 Größenordnungen beträgt.
Aber selbst wenn die BSE-Infektiosität von Milch nur ein Millionstel der Infektiosität eines BSE-Hirnes betragen würde, wäre das nicht wirklich unbedenklich. Das Titrationsexperiment, welches bei einem Verdünnungsfaktor 100.000 in RIII-Mäusen keine BSE-Infektiosität mehr nachweisen konnte, ermittelte für das eingesetzte Hirngewebe eine Ausgangsinfektiosität von mindestens 10 hoch 5,1 i.c.-Maus-lD50-Einheiten pro Gramm Rinderhirn. Bei einem Millionstel dieser Infektiosität enthielte 1 Liter Milch immer noch 126 i.c.-Maus-lD50-Einheiten. Auch wenn man berücksichtigt, dass die Infektiosität bei oraler Aufnahme durch RIII-Mäuse etwa um den Faktor 700 geringer ist [ALMQ], kommt man immer noch auf ungefähr 1 Maus-lD50-Einheit in 5,5 Litern Milch bei oraler Aufnahme. Dann wären 100 Liter Milch für etwa 9 Mäuse tödlich, wenn man diese Milch an eine ausreichend große Anzahl von Mäusen verfüttern würde. Man sieht an diesem Beispiel, dass solche Maustests gigantisch dimensioniert werden müssten, um auch nur annähernd den menschlichen Milchkonsum zu repräsentieren. Ein Mausexperiment ist in Wirklichkeit ziemlich sinnlos, wenn es im Ergebnis nur aussagt, dass man beim Genuß von 5,5 Litern Milch einer BSE-kranken Kuh eine Überlebenschance von mindestens 50% hat.
Dabei ist zu beachten, dass diese von den Mäusen getrunkenen 300 ml Milch mit von einem Menschen getrunkenen 300 ml Milch vergleichbar sind und nicht etwa im Verhältnis der Körpergewichte von Mensch und Maus hochgerechnet werden dürfen. Die Autoren weisen selbst darauf hin, dass die infektiöse Dosis wahrscheinlich nicht vom Körpergewicht des Empfängers abhängt. Dies ist offensichtlich korrekt, denn 300 mg BSE-Hirnhomogenat töteten 12 von 15 RIII-Mäusen [ALMQ], während die Verfütterung der vergleichbaren Menge von je 500 mg eines aus den Hirnen von 4 BSE-Kühen erzeugten Hirnhomogenates nach einer Inkubationszeit von 734 Tagen 1 von 6 Schafen und nach Inkubationszeiten von 941 bzw. 1501 Tagen zwei von drei Ziegen tötete [AEDA]. Das um Größenordnungen größere Gewicht des Schafes oder der Ziege hat also offensichtlich keinen wesentlichen Einfluß auf die Größe der infektiösen Dosis und deshalb macht auch seine Größe allein den Menschen nicht BSE-resistenter.
Betrachtet man also dieses Experiment nicht nur oberflächlich und rein gefühlsmäßig, sondern mit dem Bemühen um eine quantitative Bewertung, so kann das Ergebnis überhaupt nicht beruhigen. Und leider ist dieses Experiment das beruhigendste bisher durchgeführte.
MH Animal; Cattle; Encephalopathy, Bovine Spongiform/*transmission; Female; Mice; Milk/*virology; Pregnancy; Support, Non-U.S. Gov't
AD Neuropathogenesis Unit, Institute for Animal Health, Edinburgh.
SP englisch
PO England
OR Prion-Krankheiten 8
ZF kritische Zusammenfassung von Roland Heynkes