NR AOEB
AU Brown,P.; Rohwer,R.G.; Dunstan,B.C.; MacAuley,C.; Gajdusek,D.C.; Drohan,W.N.
TI The distribution of infectivity in blood components and plasma derivatives in experimental models of transmissible spongiform encephalopathy
QU Transfusion 1998; 38(9): 810-6
PT journal article
AB
BACKGROUND: The administration of blood components from donors who subsequently develop Creutzfeldt-Jakob disease has raised the issue of blood as a possible vehicle for iatrogenic disease.
STUDY DESIGN AND METHODS: We examined infectivity in blood components and Cohn plasma fractions in normal human blood that had been "spiked" with trypsinized cells from a scrapie-infected hamster brain, and in blood of clinically ill mice that had been inoculated with a mouse-adapted strain of human transmissible spongiform encephalopathy. Infectivity was assayed by intracerebral inoculation of the blood specimens into healthy animals.
RESULTS: Most of the infectivity in spiked human blood was associated with cellular blood components; the smaller amount present in plasma, when fractionated, was found mainly in cryoprecipitate (the source of factor VIII) and fraction I+II+III (the source of fibrinogen and immunoglobulin); almost none was recovered in fraction IV (the source of vitamin-K-dependent proteins) and fraction V (the source of albumin). Mice infected with the human strain of spongiform encephalopathy had very low levels of endogenous infectivity in buffy coat, plasma, cryoprecipitate, and fraction I+II+III, and no detectable infectivity in fractions IV or V.
CONCLUSION: Convergent results from exogenous spiking and endogenous infectivity experiments, in which decreasing levels of infectivity occurred in cellular blood components, plasma, and plasma fractions, suggest a potential but, minimal risk of acquiring Creutzfeldt-Jakob disease from the administration of human plasma protein concentrates.
IN
Mit lebend aus ihren Zellverbänden herausgelösten Nervenzellen und Gliazellen aus den Gehirnen zweier mit dem Scrapiestamm 263K infizierter Goldhamster wurde normales menschliches Blut künstlich infiziert, um die Infektiosität des Blutes von Creutzfeldt-Jakob-Patienten zu simulieren. Per Endpunkttitration in Hamstern wurde eine Gesamtinfektiosität von 1,26 Milliarden LD50-Einheiten ermittelt.
Als etwas realitätsnähere Variante mit dafür wesentlich geringerer Infektiosität wurden alternativ Mäuse intrazerebral mit dem an Mäuse adaptierten Fukuoka-1-Stamm infiziert, der ursprünglich von einem Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Patienten mit der P102L-Mutation stammte. Wenn diese Mäuse nach etwa 4 Monaten erkrankten, wurden sie unter leichter Betäubung durch Herzpunktur ausgeblutet. 5 Einheiten Heparin pro ml verhinderten die Verklumpung des Blutes. Insgesamt lieferten 75 Mäuse 45 ml Blut, das mit 7 ml Citrat mit 225 Einheiten Heparin stabilisieret wurde. Außerdem wurden 10%ige Suspensionen der Gehirne und Milzen dieser Mäuse für Titrationen verwendet.
Zur Auftrennung der Blutkomponenten wurden zwei gebräuchliche Verfahren benutzt. In verkleinertem Maßstab wurde das beim amerikanischen roten Kreuz verwendeten "three-bag"-Verfahren simuliert. Das mit Antigerinnungsmittel versetzte Blut wurde bei Raumtemperatur 4 Minuten lang mit 2280 g zentrifugiert. Das Plasma im Überstand wurde bei Raumtemperatur 8 Minuten lang mit 4200 g erneut zentrifugiert. Der zellfreie Plasmaüberstand wurde eingefroren. Die Sedimente wurden ebenfalls bei -70° eingefroren und im gefrorenen Zustand wurde die buffy coat - Schicht mit den Leukozyten von den darunter liegenden Erythrozyten getrennt. Im Experiment mit den Hamsterzellen in menschlichem Blut wurde diese buffy coat mit dem zweiten Sediment vereinigt.
Die Plasmafraktion wurde nach dem Schema der in der Wirtschaft weit verbreiteten Cohn-Fraktionierung weiter verarbeitet. 10 ml wurden über Nacht von -70° auf -20° erwärmt. Danach wurde das Plasma binnen 30 Minuten auf 1-2° erwärmt und bei dieser Temperatur 15 Minuten lang mit 5600 g zentrifugiert. Das Sediment wurde als sogenanntes Cryopräzipitat bei -70° eingefroren. Das verbliebene Plasma wurde bei 1-2° mit Essigsäure auf einen pH-Wert von 6,65-6,70 eingestellt. Danach wurde über einen Zeitraum von 1 Stunde in kleinen Schritten Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 20% zugegeben. Bereits bei einer Ethanolkonzentration von 10% lag der pH-Wert zwischen 6,8 und 7,0 und die Temperatur konnte auf -5 ° gesenkt werden. Bei dieser tiefen Temperatur wurde das angesäuerte Plasma-Alkohol-Gemisch 15 Minuten lang mit 5600 g zentrifugiert. Das so gewonnene Sediment wurde als Fraktion I+II+III bei -70° eingefroren. Der pH-Wert des Überstandes wurde zunächst mit Essigsäure auf pH 5,16-5,22 und anschließend mit 1 M NaHCO3 auf 5,75 angehoben. Danach wurde wieder verteilt über eine Stunde Alkohol bis zu einer Endkonzentration von 40% bei pH 5,92-5,98 zugegeben. Dieses Gemisch wurde wieder 15 Minuten lang bei -5 ° mit 5600 g zentrifugiert. Das so gewonnene Sediment wurde als Fraktion IV1/IV4 bei -70° eingefroren. Der Überstand wurde nach Zugabe von 2 mg Filtrationshilfe pro ml filtriert und bei -5° mit Essigsäure/40%Ethanol langsam auf pH 4,78-4,82 angesäuert. Durch Zentrifugation bei -5 ° mit 5600 g für 15 Minuten erhielt man das Sediment Fraktion V sowie den Fraktion V Überstand, die beide bei -70° eingefroren wurden.
Diese verschiedenen Fraktionen wurden aufgetaut, in PBS (pH 7,4) verdünnt und in Portionen von 30 µl (Blutkomponenten) oder 50 µl (Plasmafraktionen) jeweils 4-8 gesunden Hamstern bzw. in Portionen von 30 µl jeweils bis zu 130 Mäusen intrazerebral inokuliert. Die inokulierten Tiere lebten während der Inkubationszeit mit unbehandelten zusammen, um gegebenenfalls horizontale Übertragungen zu erkennen. Keine dieser Kontrollhamster bzw. Kontrollmäuse zeigte klinische oder neuropathologische Anzeichen für eine Infektion. Die inokulierten Hamter wurden 8 Monate beobachtet, die inokulierten Mäuse wurden erst nach 13 Monaten getötet.
Beim simulierten CJD-Blut fand man den größten Teil der Infektiosität in der Fraktion der Blutzellen. Im Blutplasma fand man die Infektiosität hauptsächlich im Cryopräzipitat, aus dem der Blutfaktor VIII hergestellt wird, sowie in den Fraktionen I, II und III, aus denen Fibrinogen und Immunglobuline gewonnen werden. Nahezu keine Infektiosität wurde in den Fraktionen IV, der Quellle Vitamin K - abhängiger Proteine, und in der Fraktion V gefunden, aus der Albumin gewonnen wird. Ganz ähnlich war das Ergebnis mit dem Blut der CJD-infizierten Mäuse. Nur war bei ihnen natürlich die Infektiosität deutlich geringer. Von 11 mit Vollblut, 7 mit der Fraktion der roten Blutkörperchen, 86 mit der Fraktion IV (der Quellle Vitamin K - abhängiger Proteine) und 94 mit der Fraktion V (aus der Albumin gewonnen wird) intrazerebral inokulierten Jungmäusen erkrankte während einer Beobachtungszeit von 13 Monaten keine. Als im Western blot PrPsc-positiv erwiesen sich 2 von 12 mit Leukozyten (buffy coat), 4 von 23 mit Plasmasediment, 8 von 132 mit Plasma-Überstand, 6 von 15 mit Cryopräzipitat (aus dem der Blutfaktor VIII hergestellt wird) sowie 6 von 43 mit den Fraktionen I, II und III (aus denen Fibrinogen und Immunglobuline gewonnen werden) intrazerebral inokulierten Hausmäusen. Obwohl die Autoren also eindeutig die Infektiosität verschiedener Blutfraktionen nachwiesen, beschreiben sie das Risiko einer CJD-Infektion durch infektiöse Blutplasmaproteine als minimal.
ZR 21 Zitate
MH Animal; Blood Component Removal; Blood Component Transfusion/*adverse effects; *Blood Donors; Creutzfeldt-Jakob Syndrome/transmission; Hamsters; Human; Mice; Plasma; Prion Diseases/*transmission; Risk Assessment; Scrapie/transmission; Support, U.S. Gov't, P.H.S.
AD Paul Brown (pwb@codon.nih.gov), Laboratory of CNS Studies, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20892, USA
SP englisch
PO USA
OR Prion-Krankheiten 2