NR ARDI
AU Klose,R.; Wünsch,A.; Lü,L.; Zakhartchenko,V.; Wenigerkind,H.; Wolf,E.
TI Generierung PrPc-defizienter Rinder
QU TSE-Forum, 4. Kongress - Nationale TSE-Forschungsplattform, Düsseldorf 28.10.-29.10.2004, Vortrag V-25
PT Konferenz-Vortrag
AB
Die Erzeugung Prionprotein (PrPc)-defizienter Rinder ist ein wichtiger Schritt zur Aufklärung der physiologischen Bedeutung von PrPc bei dieser Spezies. Die funktionelle Inaktivierung des PRNP-Gens wird durch zwei Gene-targeting Schritte in bovinen fetalen Fibroblasten (BFF) durchgeführt. Dabei wird die für PrPc kodierende Sequenz auf beiden Allelen des PRNP-Gens durch homologe Rekombination mit Targeting-Vektoren nacheinander durch ein Neomycin (neo)- bzw. Hygromycin (hygro)-Resistenzgen ersetzt. Nach dem ersten Targeting dienen PRNP+/- BFF als Kernspenderzellen für die Erzeugung eines Kerntransferfetus. Die daraus gewonnenen PRNP+/- BFF Primärkultur ermöglicht in einem zweiten Schritt die vollständige Deletion von PrPc in BFF, sowie die Generierung PrPc-defizienter Rinder durch Kerntransferklonierung.
Für das erste Targeting wurden 1,5 x 106 BFF mit dem neo-Vektor elektroporiert. Nach Selektion konnten 127 G418-resistente Kolonien ausreichend gut vermehrt werden, um Zellen sowohl für die Kryokonservierung als auch für die DNA-Isolierung zu verwenden. Eine Southern Blot-Analyse ergab in vier der untersuchten BFF-Kolonien das korrekte Banden-muster, das für einen homologen Genaustausch von PrPc gegen neo zu erwarten war. Die Targeting-Effizienz (Zahl der Klone mit homologem Sequenzaustausch / Zahl transfizierter Zellen) für das erste Allel lag somit bei 3,8 x 10-7.
Aus einer Kerntransferklonierung mit zwei dieser PRNP+/- BFF erhielten wir Feten, aus denen an Tag 41 bzw. 34 Primärkulturen etabliert wurden. Eine Southern Blot-Analyse bestätigte den PRNP+/- Genotyp. Diese Primärkulturen wurden für den Kerntransfer ver-wendet mit dem Ziel PRNP+/- Rinder zu erzeugen. Derzeit bestehen sechs Trächtigkeiten.
Für den Austausch des zweiten Allels wurden PRNP+/- BFF mit dem hygro-Vektor elektroporiert. Bisher konnten 38 Hygromycin-resistente Zellkolonien für Kryokonservierung und DNA-Isolierung verwendet werden. Hat ein Sequenzaustausch von PrPc gegen hygro stattgefunden, können solche PRNP-/- Kolonien mittels einer Southern Blot-Analyse identifiziert werden. Sie dienen als Kernspenderzellen für die Erzeugung PrPc-defizienter Rinder.
AD Klose,R.; Wünsch,A.; Lü,L.; Zakhartchenko,V.; Wenigerkind,H.; Wolf,E., Lehrstuhl für Molekulare Tierzucht und Biotechnologie, LMU München
SP deutsch
PO Deutschland
OR Tagungsband