NR AUKB
AU Schell,J.
TI Einfluss von Faltungshilfen auf die in vitro-Konversion von natürlichem und rekombinantem Prion-Protein aus prokaryotischen und eukaryotischen Zellkulturen
QU Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, vorgelegt von Jens Schell aus Ratingen (Kreis Mettmann) Düsseldorf 6.12.2001
IA http://diss.ub.uni-duesseldorf.de/home/etexte/diss/file?dissid=115
PT Dissertation
AB
Transmissible spongiforme Enzephalopathien sind eine Gruppe von neurodegenerativen Erkrankungen, die sowohl sporadisch als auch infektiös oder genetisch bedingt auftreten können. Der Erreger dieser Erkrankungen besteht nach dem Prion-Modell fast ausschließlich aus einer abnormal gefalteten Isoform des Prion-Proteins (PrPsc). Durch Interaktion mit der zellulären Form (PrPc) katalysiert es dessen Umwandlung in PrPsc. Die meisten experimentellen Daten stützen das Prion-Modell, auch wenn es bis heute nicht endgültig bewiesen werden konnte. Verschiedene in vitro-Konversionssysteme versuchen die Umwandlung und Eigenschaften von PrPsc nachzustellen.
Das in unserer Arbeitsgruppe etablierte in vitro-Konversionssystem induziert durch Ausdünnen von SDS eine Umwandlung von rekombinantem oder aus Prion-Stäbchen solubilisiertem Prion-Protein. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zusätzlich natürliches, posttranslational modifiziertes PrPc als Ausgangsmaterial für die in vitro-Konversion eingesetzt. Hierfür wurden ein CHO-Zellkultursystem, das PrPc überexprimiert, und die anschließende chromatographische Aufreinigung etabliert. Nach Ausdünnen des SDS aggregierten sowohl rekombinante als auch natürliche Prion-Proteine, wobei recPrP eine deutlich höhere Tendenz zur Aggregation hat. Die Aggregate weisen einige Eigenschaften von PrPsc auf, wie z.B. Unlöslichkeit und ?-Faltblattstruktur. Eine PrPsc-spezifische Protease K-Schnittstelle und Infektiosität konnte aber bisher nicht gefunden werden, so dass nicht von einer vollständigen Konversion zu PrPsc ausgegangen werden kann.
Grundsätzlich wird die fehlende Infektiosität in Zusammenhang mit falschen in vitro Faltungsbedingungen und/oder fehlenden sekundären Komponenten gebracht. Bei diesem sogenannten Faktor X, der aufgrund von Ergebnissen bei Infektionsstudien mit transgenen Tieren postuliert wurde, kann es sich um ein molekulares Chaperon handeln. Der Einfluss von verschiedenen Faltungshilfen wurde in unserem in vitro-Konversionssystem untersucht. Neben chemischen Chaperonen wurde das sehr gut charakterisierte GroEL/ES-System aus E. coli, eingesetzt. Die chemischen Chaperone DMSO und Glycerol konnten die Aggregation in vitro nicht verhindern. Im Gegensatz dazu inhibierte das molekulare Chaperon GroEL die in vitro-Aggregation durch Bindung des rekombinanten oder posttranslational modifizierten PrP. Nach Freisetzung aus dem Komplex aggregierte das PrP erneut, unabhängig davon ob das Co-Chaperon GroES zugesetzt wurde. Somit konnte das molekulare Chaperon GroEL das Prion-Protein unter diesen Bedingungen nicht in eine stabile, lösliche Form falten. Die gebildeten Aggregate ohne GroEL und nach Freisetzung von GroEL zeigten keine Unterschiede, so dass ein spezifischer Einfluss von GroEL auf die in vitro-Konversion unter diesen Bedingungen ausgeschlossen werden muss.
Das um posttranslational modifiziertes PrPc erweiterte in vitro-Konversionssystem bietet nun die Möglichkeit ausgehend von rekombinanten und natürlichen Prion-Proteinen den Einfluss weiterer sekundärer Komponenten und Faltungsbedingungen einzeln und in Kombination zu analysieren. Insbesondere kann nun der Einfluss der Membranumgebung des natürlichen PrPc auf die in vitro-Konversion untersucht werden. Neben einem besseren Verständnis des Umwandlungsprozess kann so gezielt nach Therapieansätzen gesucht werden.
AD Dr. Jens Schell, Commissariat a l'Energie Atomique, DRM/DSV/GIDTIP, 18, route du Panorama, 92265 Fontenay aux Roses, France, Tel: +33 1 46 54 95 86, Fax:+33 1 46 54 93 19, E-mail:jens.schell@cea.fr
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