Research in Veterinary Science 1964; 5: 340

Roland Heynkes, 19.1.2002

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Pattison,I.H.; Sansom,B.F. - Dialysis of the Scrapie Agent - Research in Veterinary Science 1964; 5: 340

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Im Jahr 1954 zentrifugierte Dr. D.R. Wilson im Moredun-Institut bei Edinburgh Hirnhomogenat von einem an Scrapie erkrankten Schaf über 2 Stunden mit 40.000 Umdrehungen pro Minute (Die Rotorgeometrie bzw. das daraus resultierende Vielfache der Erdbeschleunigung wird dummerweise nicht genannt.) und inokulierte nordschottische Cheviot Schafe intrazerebral teils mit dem Überstand, teils mit dem Sediment. Da sich Sediment und Überstand beide als infektiös erwiesen, beschloß man den Versuch einer Isolierung der Infektiosität durch Dialyse.

In einem ersten Experiment wurde 5 experimentell mit Scrapie infizierten und bereits deutlich klinisch erkrankten Ziegen Hirnrückenmarksflüssigkeit entnommen und zusammengemischt. Als Negativkontrolle gewann man zusätzlich ein Gemisch aus Hirnrückenmarksflüssigkeit von 4 klinisch gesunden Ziegen, die ohne Kontakt zu Scrapietieren aufwuchsen. Nach 12 Tagen Lagerung bei 0°C wurden je 15 ml Hirnrückenmarksflüssigkeit von den Scrapie-kranken bzw. von den gesunden Zeigen in getrennte Dialyseschläuche mit einem durchschnittlichen Porendurchmesser von 2,4 Mikromentern pipettiert. Nach 18-stündiger Dialyse gegen destilliertes Waser bei Raumtemperatur, inokulierte man je 3 etwa 3 Monate alte Ziegen intrazerebral mit je 1 ml nicht dialysierter Hirnrückenmarksflüssigkeit, des dialysierten Beutelinhaltes und des zur Dialyse verwendeten Wassers. Ebenfalls insgesamt 9 Ziegen setzte man analog für die Negativkontrollen ein. Innerhalb eines Beobachtungszeitraumes von allerdings nur 21 Monaten erkrankte keines der 9 Empfängertiere aus der Negativkontrollgruppe und auch keine der 3 Ziegen, welche mit dem den Dialysebeutel umgebenden Wasser inokuliert worden waren. Im Gegensatz dazu erkrankten die 3 mit nicht dialysierter Hirnrückenmarksflüssigkeit der Scrapie-kranken Ziegen inokulierten Empfängerziegen nach 14, 15, bzw. 20 Monaten. Von den 3 mit dialysierter Hirnrückenmarksflüssigkeit der Scrapie-kranken Ziegen inokulierten Empfängerziegen erkrankten zwei nach 15, bzw. 18 Monaten. Insgesamt war dieses Experiment zu klein angelegt, um aus den negativen Resultaten belastbare Schlüsse zu ziehen.

Im zweiten Experiment wurde 15 schwer an Scrapie erkrankten Ziegen Hirnrückenmarksflüssigkeit entnommen und zusammengemischt. Danach dialysierten zwei Experimentatoren jeweils die Hälfte des Gemisches im Prinzip wie im ersten Experiment. Diesmal inokulierte man 2 etwa 3 Monate alte Ziegen intrazerebral mit je 1 ml gekochtem, destilliertem Wasser (Negativkontrolle), 4 Tiere mit je 1 ml nicht dialysierter Hirnrückenmarksflüssigkeit, 3 Ziegen je Experimentator mit je 1 ml des dialysierten Beutelinhaltes und 6 Ziegen je Experimentator mit je 1 ml des zur Dialyse verwendeten Wassers. Innerhalb des Beobachtungszeitraumes von allerdings nur 22 Monaten erkrankte keines der beiden Empfängertiere aus der Negativkontrollgruppe nach Inokulation von gekochtem Wasser. In der Positivkontrollgruppe mit nicht dialysierter Hirnrückenmarksflüssigkeit starben alle 4 Ziegen nach 10, 11, 12 bzw. 16 Monaten. Hinsichtlich der eigentlichen Dialyseexperimente waren die Ergebnisse der beiden Experimentatoren sehr unterschiedlich. Bei dem einen erkrankte lediglich eine Ziege 15 Monate nach der Inokulation mit 1 ml des dialysierten Beutelinhaltes an Scrapie. Drei weitere von diesem Experimentator inokulierte Ziegen starben jung aus anderen Gründen. Im Gegensatz dazu erkrankten innerhalb des Beobachtungszeitraumes beim anderen Experimentator alle inokulierte Ziegen, mit Ausnahme einer mit dem zur Dialyse verwendeten Wasser inokulierten Ziege. Insgesamt sind daher die Ergebnisse dieses Experimentes nicht wirklich überzeugend.

Im dritten Experiment wurden nach leichter Zentrifugation je 5 ml der Überstände 10%iger Homogenate von den Gehirnen dreier an Scrapie erkrankter Ziegen je 24 Stunden dialysiert. Dabei wurde die Dichtigkeit der Dialyseschläuche durch die Beifügung radioaktiv markierten Serumalbumins überprüft. Außerdem wurden die verschlossenen Schläuche vor der Dialyse abgewaschen, damit keine Infektiosität ins Dialysebad verschleppt werden konnte. Natürlich wurden für die Inokulation nur Proben verwendet, bei denen der Austritt sehr geringer Mengen von Radioaktivität für völlig intakte Dialyseschläuche sprach. Immerhin 12 von 48 Dialyseschläuchen erwiesen sich als undicht. Als Kontrollen wurden auch je 3 Schläuche mit steriler Salzlösung bzw. dem Überstand von Hirnhomogenat gesunder Schafe dialysiert. Intrazerebral mit je 1 ml inokuliert wurden pro Spenderziege je 2 Ziegen mit Material von innerhalb bzw. außerhalb eines Schlauches mit normalem Hirnhomogenatüberstand, nicht dialysiertem Hirnhomogenatüberstand der Scrapie-kranken Ziege, sowie Material von innerhalb eines Schlauches mit Hirnhomogenatüberstand der Scrapie-kranken Ziege. Mit Material von außerhalb eines Schlauches mit dialysiertem Hirnhomogenatüberstand der Scrapie-kranken Ziege wurden 6 junge Ziegen inokuliert. Bei 14 Empfängerziegen für jede der 3 Spenderziegen wurden also insgesamt 42 Ziegen inokuliert. In allen drei Teilexperimenten erkrankte kein Empfängertier der Negativkontrollgruppe, während alle 6 mit nicht dialysiertem Hirnhomogenat inokulierte Empfängerziegen nach relativ kurzen Inkubaionszeiten an Scrapie erkrankten. Von den insgesamt 6 mit je 1 ml des dialysierten Beutelinhaltes inokulierten Empfängerziegen starben nur 4 an Scrapie, eine starb kurz nach der Inokulation. Die Inkubationszeiten der erkrankten waren vielleicht tendentiell etwas länger als bei den 6 mit nicht dialysiertem Hirnhomogenat inokulierten Empfängerziegen. Von den insgesamt 18 mit Material von außerhalb eines Schlauches mit dialysiertem Hirnhomogenatüberstand der Scrapie-kranken Ziege inokulierten jungen Ziegen erkrankten mit deutlich längeren Inkubationszeiten 10 Tiere. Angesichts der durchgeführten Kontrollen liefert dieses Experiment noch nicht unbedingt einen Beweis, aber doch ein starkes Argument für die Annahme, daß ein Teil der Scrapieinfektiosität durch Poren mit einem Durchmesser von nicht viel mehr als 2,4 Mikrometern hindurch paßt.

Im vierten Experiment wurden 10 ml des des Hirnhomogenatüberstandes der ersten an Scrapie erkrankter Ziegen aus dem dritten Experiment mit radioaktiver Dichtheitskontrolle 14 Tage lang gegen einen kontinuierlichen Fluß (1 Liter pro Stunde) vermutlich physiologischer Salzlösung (0,9%) dialysiert. Dabei wurde die Dichtigkeit der Dialyseschläuche durch die Beifügung radioaktiv markierten Serumalbumins überprüft. Nach 7 und nach 14 Tagen wurden Proben aus dem Schlauch entnommen und die Dichtigkeit festgestellt. Mit einem Teil der Proben wurden nach 7 Tagen 2 und nach 14 Tagen 4 Ziegen intrazerebral inokuliert. Zum Vergleich wurden auch je 2 junge Ziegen mit gleichen Mengen des selben, jedoch nicht dialysierten Hirnhomogenates inokuliert. In diesem Experiment starben 3 Tiere kurz nach der Inokulation und alle übrigen erkrankten an Scrapie. Die Inkubationszeiten waren nach 14-tägiger Dialyse deutlich länger, aber sie waren nach 7-tägiger Dialyse auch deutlich kürzer als bei den Positivkontrolen mit nicht dialysiertem Inokulum. Die Unterschiede könnten daher auch rein zufällige Unterschiede aufgrund der sehr kleinen Empfängertierzahlen sein. Insgesamt bestätigt aber auch das 4. Experiment, daß bei einem mittleren Porendurchmesser von 2,4 Mikrometern der größte Teil der Infektiosität den Dialysebeutel nicht verläßt. Die Autoren erklären dies sehr vernünftig mit der Annahme, daß das infektiöse Agens hinsichtlich seiner Größe variabel sein, oder sich teilweise an nicht dialysierbare größere Partikel anheften müsse. Die Autoren finden die teilweise Dialysierbarkeit des Scrapie-Erregers zwar überraschend, ziehen daraus aber in dieser Publikation noch nicht den Schluß, daß es sich wahrscheinlich nicht um ein Virus handeln könne.

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