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Roland Heynkes, 15.4.2004
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Pan,T.; Li,R.; Wong,B.-S.; Liu,T.; Gambetti,P.; Sy,M.-S. - Heterogeneity of normal prion protein in two-dimensional immunoblot: presence of various glycosylated and truncated forms. - Journal of Neurochemistry 2002 Jun; 81(5): 1092-101
Die Autoren machen darauf aufmerksam, daß die Verwendung nur eindimensionaler Gele und nur eines Antikörpers zur Markierung dazu geführt habe, daß die Vielfalt der Prionproteine im Gehirn bisher übersehen wurde. So ganz korrekt ist diese Kritik nicht, denn polyklonale Antiseren beinhalten schon eine gewisse Vielfalt. Aber tatsächlich sieht man im normalen eindimensionalen Western blot nur die drei Banden der nicht (29-30 kDa), einfach (31-32 kDa) oder zweifach (35-37 kDa) glykosilierten Prionproteine, sowie eventuell noch ein bis zwei Abbauprodukte (21-22 kDa und 18-19 kDa). Nach Einschätzung der Autoren wird dabei verbreitet der monoklonale Antikörper 3F4 verwendet, der das Prionprotein nicht mehr erkennt, wenn der Aminoterminus bis zu den Aminosäuren 111/112 abgeknabbert wurde. Und natürlich trennen normale Protein-Gele unabhängig von den Ladungen der Proteine nur nach deren Größen.
Die Autoren selber verwendeten eine zweidimensionale Gelelektrophorese und mehrere monoklonale Antikörper. Im einzelnen waren dies: 8B4 gegen ein Epitop zwischen den Aminosäuren 34 und 45 [AHGC], 3F4 gegen die Aminosäuren 109-112 [AGFB], 8H4 gegen ein Epitop zwischen den Aminosäuren 173 und 185 [AMXU] und 8F9 gegen die Aminosäuren 213-231. Damit konnten sie zeigen, daß es in den Gehirnen dreier nicht an der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit gestorbener Patienten über 50 hinsichtlich der Kombination von isoelektrischem Punkt und Molekularmasse unterschiedliche Formen des normalen Prionproteins gab. Neben unterschiedlichen Längen des Prionproteins sind für diese Variabilität offenbar vor allem unterschiedlich strukturierte Glykosilierungen verantwortlich. Die unterschiedlichen Proteinlängen sind auf verschiedene Protease-Schnittstellen am Aminoterminus des Prionproteins zurückzuführen. Insgesamt wurden so nach der isoelektrischen Fokussierung als erster Dimension in der normalen SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese als zweiter Dimension 7 hinsichtlich der Molekularmasse unterscheidbare Formen erkennbar. Die größte Form (37 kDa) verteilt sich auf 14 Punkte mit pI im Bereich von pH 4,5-8,0. Die mit 35-36 kDa zweitgrößte Form bildet ungefähr 8 Punkte mit pI im Bereich von pH 5,5-8,0. Nur diese beiden Varianten werden vom Antikörper 8B4 gegen den Aminoterminus erkannt, sind also zumindest an diesem Ende nicht verkürzt.
Es gibt noch eine weitere 35-36 kDa große Form, die ebenfalls rund 8 Punkte bildet, deren pI aber im Bereich von pH 4,5-6,0 rangieren. Trennen lassen sich diese beiden gleich großen Formen des Prionproteins nur durch Immunopräzipitation mit unterschiedlichen Antikörpern vor der ersten Gelelektrophorese. Die vierte Spezies hat eine scheinbare Molekularmasse von 33-35 kDa und bildet 3-4 kleine Punkte im Bereich von pH 4,5-5,0. Spezies III und IV reagieren nicht mit Antikörper 8B4 gegen den Aminoterminus, aber mit Antikörper 3F4 gegen die Aminosäuren 109-112. Wahrscheinlich sind ihre Aminotermini etwa bis zur Aminosäure 90 abverdaut. Die größere Variante III dürfte diglykosiliert sein, während die kleinere Form IV offenbar nur einen Zuckerbaum trägt. Man nennt beide C2-Formen und sie kommen unter normalen Bedingungen in kleinen Mengen vor [ACNW,AGAP].
Eine fünfte 30-33 kDa große Form bildet 6-7 Punkte mit pI im Bereich von pH 5,5-6,0, wenn in der ersten Dimension (isoelektrische Fokussierung) die Standardlaufzeit von 4,5 Stunden gewählt wurde. Nach einer Verkürzung der Laufzeit auf 3 Stunden fanden sie nach der isoelektrischen Fokussierung 11-12 Varianten dieser Form V. Die sechste Variante zeigt eine scheinbare Molekularmasse von 25-29 kDa und bildet 6-7 Punkte mit pI im Bereich von pH 4,5-6,0. Spezies 7 weist eine scheinbare Molekularmasse von 18-20 kDa auf und bildet 3 Punkte mit pI im Bereich von pH 5,5-6,5. Diese drei Varianten werden von den Antikörpern 8H4 und 8F9 erkannt und repräsentieren wahrscheinlich die zweifach, einfach bzw. nicht glykosilierten Formen des zur Aminosäure 112 aminoterminal verkürzten Prionproteins [ACNW]. Sie reagieren deshalb so sauer, weil sie mit 7 Lysinen und 3 Argininen durch die Abspaltung des erweiterten Aminoterminus 10 basische Aminosäuren verloren haben.
Nach enzymatischer Abspaltung der Zuckerreste mit dem Enzym PNGase F sind nur noch 3 oder 4 unterschiedlich große Varianten erkennbar, die sich auch hinsichtlich ihrer isoelektrischen Punkte nur noch in eine wesentlich kleinere Anzahl unterscheidbarer Varianten auftrennen lassen. Insbesondere laufen nach der Abspaltung der Zuckerreste die Spezies III und IV, sowie die Spezies V, VI und VII in der zweiten Dimension wegen nun identischer Molekularmassen jeweils auf gleicher Höhe.
Wird zusätzlich durch eine Behandlung mit Fluorwasserstoff (HF bzw. eigentlich Flußsäure) auch der GPI-Anker vom Prionprotein abgespalten, dann reduziert sich die Zahl der Punkte noch weiter, weil es offenbar auch hinsichtlich des GPI-Ankers noch Varianten gibt.
Zur näheren Untersuchung der Glykosilierung des Prionproteins entfernten die Autoren mit Neuraminidase endständige Sialinsäure-Reste. Dabei stellte sich anhand des veränderten Wanderungsverhaltens heraus, daß sich einige der zuvor beobachteten Varianten nur durch verschiedene Sialinsäure-Reste unterschieden hatten und das die verkürzten Formen des Prionproteins auch weniger Sialinsäure-Reste enthielten. Bestätigen ließ sich dies dadurch, daß die verkürzten Formen des Prionproteins trotz insgesamt geringerer Glykosilierung doppelt so stark wie die ungekürzten Varianten verschiedene Lektine banden, die bevorzugt alpha-1,3- and -1,6-Fukose und Mannose erkennen.
Die Autoren vermuten einen Einfluß der vielfältigen Glykosilierungen auf die Funktionen des Prionproteins und eine Grundlage für die Vielfalt der TSE-Stämme.
ACNW . Chen,S.G.; Teplow,D.B.; Parchi,P.; Teller,J.K.; Gambetti,P.; Autilio-Gambetti,L. - Truncated forms of the human prion protein in normal brain and in prion diseases - Journal of Biological Chemistry 1995 Aug 11; 270(32): 19173-80
AGAP . Jimenez-Huete,A.; Lievens,P.M.-J.; Vidal,R.; Piccardo,P.; Ghetti,B.; Tagliavini,F.; Frangione,B.; Prelli,F. - Endogenous proteolytic cleavage of normal and disease-associated isoforms of the human prion protein in neural and non-neural tissues - American Journal of Pathology 1998 Nov; 153(5): 1561-72
AGFB . Kascsak,R.J.; Rubenstein,R.; Merz,P.A.; Tonna-DeMasi,M.; Fersko,R.; Carp,R.I.; Wisniewski,H.M.; Diringer,H. - Mouse polyclonal and monoclonal antibody to scrapie-associated fibril proteins - Journal of Virology 1987 Dec; 61(12): 3688-93
AHGC . Li,R.; Liu,T.; Wong,B.-S.; Pan,T.; Morillas,M.; Swietnicki,W.; O'Rourke,K.; Gambetti,P.; Surewicz,W.K.; Sy,M.-S. - Identification of an epitope in the C terminus of normal prion protein whose expression is modulated by binding events in the N terminus - Journal of Molecular Biology 2000 Aug 18; 301(3): 567-73
AMXU . Zanusso,G.; Liu,D.; Ferrari,S.; Hegyi,I.; Yin,X.; Aguzzi,A.; Hornemann,S.; Liemann,S.; Glockshuber,R.; Manson,J.C.; Brown,P.; Petersen,R.B.; Gambetti,P.; Sy,M.-S. - Prion protein expression in different species: analysis with a panel of new mAbs. - Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1998 Jul 21; 95(15): 8812-6
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